• IPA:使用二代测序和生物信息学方法鉴定新的参与成骨细胞老化的基因

IPA:使用二代测序和生物信息学方法鉴定新的参与成骨细胞老化的基因

借助二代测序和生物信息学方法鉴定新的参与成骨细胞老化的基因摘要在老化过程中,成骨细胞的功能受损是骨形成失调和骨损失过程中的一个重要影响因子。 本研究的目的是在正常的和老化的成骨细胞中找出差异表达的基因,并鉴定与骨生理改变相关的基因。

IPA案例:使用二代测序和生物信息学方法鉴定新的参与成骨细胞老化的基因

摘要

在老化过程中,成骨细胞的功能受损是骨形成失调和骨损失过程中的一个重要影响因子。本研究的目的是在正常的和老化的成骨细胞中找出差异表达的基因,并鉴定与骨生理改变相关的基因。基于二代测序和生物信息学方法,鉴定得到12个差异表达的microRNAs和22个差异表达的基因。从一个骨质疏松性髋骨折芯片数据(GSE74209)中鉴定得到miR-204-5p的上调。miR-204-5p的潜在靶标分子有Kruppel-like factor 7(KLF7)和SRY-box 11(SOX11)。通过Ingenuity pathway analysis(IPA)查询到SOX11和miR-204-5p(作为上游调控因子)参与了骨关节炎通路和成骨细胞分化,这暗示了miR-204-5p-SOX11调控网络在人类骨质老化过程中的重要角色。此外,由于semaphorin 3A(SEMA3A)和ephrin type-A receptor 5 (EPHA5)参与了神经系统相关的生物学功能,作者提出一个假设,认为SEMA3A、EPHA5和神经原性的异位骨化之间有一定关联。本研究在老年人肌肉骨骼疾病的诊断中找到一个新的候选基因,为寻找神经原性异位骨化生物标志物提供了新视野。

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方法

鉴定成骨细胞老化过程中潜在的microRNA-mRNA互作网络

对P1和P8期的人类成骨细胞(OB)进行small RNA的二代测序,设定fold change>2,RPM>10,得到29个microRNA,如表1。

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使用miRmap中的microRNA靶标预测工具预测这个10上调microRNAs和19个下调microRNAs的潜在靶标基因,打分>99.0的为高置信度的。由10个上调的microRNAs得到381个靶标基因(412个潜在互作关系),由19个下调microRNAs得到606个靶标基因(790个潜在互作关系)。作者使用IPA中的“Compare Dataset”工具(位于Overlay中),将得到的靶标基因同RNA-seq得到的差异基因(fold change >2)进行映射,得到22个靶标基因(11个下调的,11个上调的),如图2A,29个差异表达microRNAs的热图分析结果如图2B,值为z-score值。

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Figure 2: Identification of differentially expressed microRNAs and genes with potential microRNA-mRNA interactions in human primary osteoblasts.

 

骨质疏松性髋骨中miR-204-5p和miR-335-3p的差异表达

5个上调的microRNAs和7个下调的microRNAs,分别对应图2A中映射得到的11个下调基因和11个上调基因,如表2。

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为了确定鉴定到的这些microRNAs与骨质老化有临床显著性,作者搜索了GEO数据库,寻找与骨质老化疾病,如OA和骨质疏松,相关的芯片数据,并找到一个相关的芯片数据(GEO accession: GSE74209)。这个数据来自6位骨质疏松性股骨颈骨折的女士和6位有臀部OA但无骨质疏松的女士。在这组芯片数据中分别分析上面鉴定得到的12个差异表达的microRNAs,结果显示,骨质疏松性股骨颈骨折的女士同有臀部OA但无骨质疏松的女士相比,mi-R-204-5p有显著上调,而miR-335-3p则显著下调,图3A和3B。如表2所示,KLF7和SOX11被预测为是miR-204-5p的靶标,KIAA1462和SVIP被预测为是miR-335-3p的靶标。

作者进一步使用IPA鉴定与这22个靶标基因相关的疾病和功能(Diseases and Functions)。得到了与cancer、organ injury and abnormality、tissue morphology、endocrine system disorders、cellular development、cell-mediated immune response和cellular movement相关的三个Networks。Network1和Network2有更高的打分,并各有10个靶标分子参与,如表3。在上文鉴定到的4个靶标分子中,有3个靶标分子((KLF7、SOX11和SVIP)参与了Network2。在这两个microRNAs中,miR-204-5p被IPA预测为是一个上游调控因子(p-value of overlap = 8.15E-03,可靶标此数据集中的EPHA5、PID1、PLAG1和SOX11分子),如图4B。使用“Overlay”工具,作者找到了参与osteoarthritis pathway、Wnt/β-catenin pathway和differentiation of osteoblasts的分子,图4B中以紫色标识,SOX11是唯一一个全部都参与的分子。然后,作者又在miRmap、TargetScan和miRDB数据库中,分析了miR-204-5p在SOX11 3′UTR上的结合位点和序列,得到3个靶标位点:589-595(miRmap score 99.41);985–991(miRmap score 96.12)和5910–5916(miRmap score 93.40),如图5。以上结果表明miR-204-5p对SOX11的调控对于人类骨质老化过程发挥重要功能。

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Figure 4: Prediction of network of genes involved in the regulation of miR-204-5p in aging human osteoblasts. 

(A)在IPA中对22个候选基因进行network分析,其中有10个基因参与了cancer、endocrine system disorders、organismal injury和abnormalities;在miR-204-5p和miR-335-3p的4个靶标分子中,有3个分子(KLF7、SOX11和SVIP)参与了此网络。绿色表示下调,红色表示上调。

(B)miR-204-5p被IPA鉴定为是一个潜在的上游调控因子,使用IPA的Overlay工具,将参与osteoarthritis pathway、Wnt/β-catenin pathway和differentiation of osteoblasts等通路的分子被标记为紫色,SOX11同时参与了这三个通路。

 

miR-204-5p-SOX11调控网络分析

使用IPA中的“Overlay”工具,探索miR-204-5p-SOX11的潜在调控网络和下游调控效应,发现网络中的ALPL、CYP1B1、EGR1、GREM1、IGFBP5、PRDM1和SOX11分子与differentiation of osteoblast and muscle cells、bone mineralization and mineral density和osteoclastogenesis有关,如表4。

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鉴定与人成骨细胞老化相关的差异表达基因和通路

作者借助NGS RNA-seq方法,来比较P1和P8期人成骨细胞中差异表达的基因(Fold change >2)。相对于P1期,在P8期中一共得到504个上调的基因和385个下调的基因。将差异表达的基因上传到IPA中,来寻找这些基因所参与的通路。IPA分析结果显示,有133个显著相关的经典通路与这些差异表达的基因相关。在最主要的10个经典通路中,有30个分子参与了OA和类风湿性关节炎(RA)相关的通路(16个上调的基因和14个下调的基因)。这些差异表达的基因被归类到25个Networks中,鉴定相关基因所用的疾病和功能(Disease and Functions)有bone mineral density、differentiation of osteoblasts、osteoarthritis和damage of cartilage tissue。Network分析如图6,SOX11连接了osteoblast differentiation和bone mineral density两个网络,它被预测为可以抑制EGR1,激活PRDM1,而这两个分子恰好位于bone mineral density网络中。

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Figure 6: Merged skeletal diseases and functions network and prediction of target molecules.

 

EPHA5和SEMA3A的上调参与了axon guidance pathway

将microRNA-mRNA网络中的22个基因输入到DAVID数据库,来分析相关的生物学过程和通路,并找出参与成骨细胞老化的潜在机制。结果表明2个基因:EPHA5和SEMA3A,参与了axon guidance pathway(表5)。这个结果同IPA的network分析结果完全一致,IPA中将22个候选基因Network分析结果中的network1(Table 3)同axon guidance signaling经典通路进行Overlay,结果显示EPHA5和SEMA3A也参与了该信号通路(图7)。使用DAVID数据库中进行gene ontology分析,兴趣基因所参与的生物学过程词汇如图8所示。绝大多数上面提及的基因(KLF7、SOX11、EPHA5和SEMA3A)都参与了神经系统相关的生物学功能,包括axon guidance、sympathetic nervous system development和dendrite morphogenesis。

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Figure 7: Network of genes potentially involved in axon guidance signaling pathway in aging human osteoblasts

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Figure 8: Biological process analysis of candidate genes in aging human osteoblasts



讨论

最后作者对以上结果进行了讨论总结,如图9,提出:miR-204-5p-SOX11在骨质老化过程中发挥发挥重要作用,miR-204-5p的上调导致SOX11的下调,造成成骨细胞的细胞周期阻滞,最终导致老年人的骨流失;差异表达的SEMA3A和EPHA5同axon guidance、sympathetic nervous system development和dendrite morphogenesis等生物学过程相关,这为骨质老化和神经源性异位骨化(HO)的临床相关性提供了分子依据,中枢神经系统的损伤,如脑和脊髓,促进软组织中的骨成熟。

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原文:

Oncotarget. 2017 Nov 28;8(69):113598-113613. doi: 10.18632/oncotarget.22748. eCollection 2017 Dec 26. Identification of novel genes in aging osteoblasts using next-generation sequencing and bioinformatics. Chen YJ(1)(2), Chang WA(1)(3), Huang MS(4)(5), Chen CH(2)(6), Wang KY(7), Hsu YL(8), Kuo PL(1)(8)(9).

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